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利用MD微孔板讀板機對細胞內氧化自由基吸收能力(ORAC)進行分析
2020-06-24
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返回列表引言
活性氧簇 (Reactive oxygen species ， ROS) 是由細胞內正常代謝反應 ，環境壓力 以及紫外輻射產生的一類物質 ，包括過氧 自由基 、羥基自由基 、超氧離子和單線態 氧 。氧化自由基吸收能力 (oxygen radical absorbance capacity ，ORAC) 分析是一 種用來評估生理液 、食品 、飲料以及天然 產物抗氧化能力的標準方法 ，它可以定量 檢測樣品清除自由基的能力 。通常自由基 能夠與細胞內組分發生反應 ，破壞正常組 織 ，引起基因突變 ，破壞細胞周期正常運 轉 ，導致癌症和其他疾病 。
這裏恒耀平台展示的是如何利用 Molecular Devices 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS 及SoftMax Pro 軟件聯合 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC Assay 來檢測不同果汁 的抗氧化能力 ，並突出了該方法簡單易行 的特點 。
檢測原理
該檢測是基於由偶氮二異丁脒鹽酸鹽 (2, 2’-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride ，AAPH) 熱解產生的過氧 自由基，在氧自由基吸收物質存在的條件 下與熒光素反應 ，從而影響熒光信號強度 這一原理的 。氧自由基吸收物質的能力越 強 ，清除的過氧自由基也就越多 ，熒光信 號持續的時間也就越長 。為了獲得待測樣 品的抗氧化能力 ，可在熒光強度對時間作 圖的曲線中 ，計算樣品曲線下方的 區域麵 積 ，並扣除空白樣品曲線下方的區域麵積 得到結果 。最終結果以一種維生素E的類 似物 Trolox™ 的抗氧化能力表示 。
材料
• Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑 盒 ，Part No. STA-345
• MD 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS
• Greiner FLUOTRAC™ 200 全黑微孔板
• 待測樣品 ：白蔓越橘汁 ，白葡萄汁 ，橙汁 ， 石榴汁 ，藍莓汁 ，紅酒
方法
以下步驟根據 Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑盒中的操作流程建立 。
試劑製備
熒光素探針製備：將試劑盒中所提供的熒光 素探針用所提供的分析稀釋液稀釋 100 倍 ， 混勻後標記為 1×熒光素工作液 。
分析稀釋液製備：分析稀釋液按 1:4 的比 列用去離子水稀釋混勻 ，稀釋後的液體可 為所有樣品和標準品稀釋所用 ，4℃保存 。 樣品製備 ：果汁和紅酒樣品預先 4℃ 離心 10 分鍾 (5-10,000 x g) 去除顆粒 ，隨後上 清在分析檢測前稀釋 100 到 1000 倍 。
抗氧化劑標準曲線繪製
所需標準品濃度可通過稀釋 1000 μM 的抗 氧化劑標準品儲液來獲得 ，現配現用 。濃 度梯度稀釋關係如表 1 所示 ，零濃度 Trolox 標準品可作為空白對照 。
注 ：每個標準品和待測樣品均需要準備 2 或 3 個複孔用於分析 。每次分析都需要新鮮配 製標準品 。
分析步驟
1. 25 μL 抗氧化劑標準品和樣品加入 96 孔板 中 ，每個樣品 2 個複孔 。
2. 每孔加入 150 μL 1×熒光素工作液 ，微孔 板充分混勻後放入預熱的微孔板讀板機中 37℃ 孵育 30 分鍾 。
3. 用多道移液器移取 25 μL 自由基起始液至 每孔中 。
4. 加入自由基起始液後立即震板 15 秒以便混 勻液體 。微孔板在讀板前需在儀器上震板 5 秒 。
5. 利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板 機 Gemini™ XPS 讀取每孔的動力學熒光信 號 。在 SoftMax Pro 軟件中激發光波長設為 485 nm ，發射光波長設為 520 nm ，cutoff 設為 515 nm 。微孔板一次整板讀取時間為 1 分鍾 ，總共持續 60 分鍾 。
注 ：到分析結束時 ，最終熒光信號強度應小 於初始熒光強度的 10% ，否則應提高樣品的 稀釋倍數重新檢測 。
結果計算
1. 利用 SoftMax Pro 軟件計算每個樣品和標 準品的曲線下方區域麵積 (Area under the curve ，AUC) 。
2. 每個樣品和標準品的淨 AUC 應當通過扣 除空白對照的 AUC 獲得 。
3. 以淨 AUC 值為縱軸，Trolox 抗氧化劑標 準品濃度為橫軸作圖 。
4. 待測樣品的 Trolox 濃度當量 ( TE ，單位 μM ) 可根據標準曲線計算獲得 ，結果用 μM TE/mL 表示 。
結果
標準曲線繪製及數據分析均采用 SoftMax Pro 軟件處理 。Trolox 標準品的動力學曲線如圖 1 所示 。每個標準品的淨 AUC 通過扣除空白 對照的 AUC 獲得 。圖 2 顯示的是每個 Trolox 標準品的淨 AUC 對濃度作圖獲得的標準曲 線 。所有樣品都需要計算淨 AUC 。從 Trolox 標準曲線算出每個樣品的 ORAC 值⸺以 Trolox 濃度當量 ( TE ，單位 μM ) 表示 ，並 乘以各自的稀釋倍數算出最終 ORAC 值 ， 單位 μMTE/mL 。稀釋 100 倍的樣品的信號 值超出標準曲線範圍 ，稀釋 1000 倍的樣品 的信號值在標準曲線範圍內 ，其 ORAC 值如 表 2 所示 。待測樣品中紅酒的 ORAC 值最高 ， 而的白蔓越橘汁 ORAC 值最低 。需要注意的 是來自不同製造商生產出的產品的組分可能 不同 ，會引起樣品 ORAC 值的不同 。
總結
利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板機 Gemini™ XPS 可以方便地進行 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC 分析 ，同時儀器配套 的 SoftMax Pro 軟件可以自動計算結果並 完成標準曲線繪製 。
需要注意的是 Molecular Devices 其他多 功能微孔板讀板機如 （SpectraMax M2 、 M2e 、M3 、M4 、M5 、M5e 、Paradigm®） 以及 FilterMax™ F5 都能夠提供熒光檢測 模式 ，且都可以進行OxiSelect ORAC 分 析 。FlexStation® 3 台式多功能微孔讀板 機還能夠進行自動化加樣 。
StakMax® 微孔板堆板機可與 SpectraMax Gemini 係列以及 M 係列微孔讀板機整合使 用以提高通量。
References
1. Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.
2. Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem. 44, 701-705.
活性氧簇 (Reactive oxygen species ， ROS) 是由細胞內正常代謝反應 ，環境壓力 以及紫外輻射產生的一類物質 ，包括過氧 自由基 、羥基自由基 、超氧離子和單線態 氧 。氧化自由基吸收能力 (oxygen radical absorbance capacity ，ORAC) 分析是一 種用來評估生理液 、食品 、飲料以及天然 產物抗氧化能力的標準方法 ，它可以定量 檢測樣品清除自由基的能力 。通常自由基 能夠與細胞內組分發生反應 ，破壞正常組 織 ，引起基因突變 ，破壞細胞周期正常運 轉 ，導致癌症和其他疾病 。
這裏恒耀平台展示的是如何利用 Molecular Devices 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS 及SoftMax Pro 軟件聯合 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC Assay 來檢測不同果汁 的抗氧化能力 ，並突出了該方法簡單易行 的特點 。
檢測原理
該檢測是基於由偶氮二異丁脒鹽酸鹽 (2, 2’-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride ，AAPH) 熱解產生的過氧 自由基，在氧自由基吸收物質存在的條件 下與熒光素反應 ，從而影響熒光信號強度 這一原理的 。氧自由基吸收物質的能力越 強 ，清除的過氧自由基也就越多 ，熒光信 號持續的時間也就越長 。為了獲得待測樣 品的抗氧化能力 ，可在熒光強度對時間作 圖的曲線中 ，計算樣品曲線下方的 區域麵 積 ，並扣除空白樣品曲線下方的區域麵積 得到結果 。最終結果以一種維生素E的類 似物 Trolox™ 的抗氧化能力表示 。
材料
• Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑 盒 ，Part No. STA-345
• MD 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS
• Greiner FLUOTRAC™ 200 全黑微孔板
• 待測樣品 ：白蔓越橘汁 ，白葡萄汁 ，橙汁 ， 石榴汁 ，藍莓汁 ，紅酒
方法
以下步驟根據 Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑盒中的操作流程建立 。
試劑製備
熒光素探針製備：將試劑盒中所提供的熒光 素探針用所提供的分析稀釋液稀釋 100 倍 ， 混勻後標記為 1×熒光素工作液 。
分析稀釋液製備：分析稀釋液按 1:4 的比 列用去離子水稀釋混勻 ，稀釋後的液體可 為所有樣品和標準品稀釋所用 ，4℃保存 。 樣品製備 ：果汁和紅酒樣品預先 4℃ 離心 10 分鍾 (5-10,000 x g) 去除顆粒 ，隨後上 清在分析檢測前稀釋 100 到 1000 倍 。
抗氧化劑標準曲線繪製
所需標準品濃度可通過稀釋 1000 μM 的抗 氧化劑標準品儲液來獲得 ，現配現用 。濃 度梯度稀釋關係如表 1 所示 ，零濃度 Trolox 標準品可作為空白對照 。
注 ：每個標準品和待測樣品均需要準備 2 或 3 個複孔用於分析 。每次分析都需要新鮮配 製標準品 。
分析步驟
1. 25 μL 抗氧化劑標準品和樣品加入 96 孔板 中 ，每個樣品 2 個複孔 。
2. 每孔加入 150 μL 1×熒光素工作液 ，微孔 板充分混勻後放入預熱的微孔板讀板機中 37℃ 孵育 30 分鍾 。
3. 用多道移液器移取 25 μL 自由基起始液至 每孔中 。
4. 加入自由基起始液後立即震板 15 秒以便混 勻液體 。微孔板在讀板前需在儀器上震板 5 秒 。
5. 利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板 機 Gemini™ XPS 讀取每孔的動力學熒光信 號 。在 SoftMax Pro 軟件中激發光波長設為 485 nm ，發射光波長設為 520 nm ，cutoff 設為 515 nm 。微孔板一次整板讀取時間為 1 分鍾 ，總共持續 60 分鍾 。
注 ：到分析結束時 ，最終熒光信號強度應小 於初始熒光強度的 10% ，否則應提高樣品的 稀釋倍數重新檢測 。
結果計算
1. 利用 SoftMax Pro 軟件計算每個樣品和標 準品的曲線下方區域麵積 (Area under the curve ，AUC) 。
2. 每個樣品和標準品的淨 AUC 應當通過扣 除空白對照的 AUC 獲得 。
3. 以淨 AUC 值為縱軸，Trolox 抗氧化劑標 準品濃度為橫軸作圖 。
4. 待測樣品的 Trolox 濃度當量 ( TE ，單位 μM ) 可根據標準曲線計算獲得 ，結果用 μM TE/mL 表示 。
結果
標準曲線繪製及數據分析均采用 SoftMax Pro 軟件處理 。Trolox 標準品的動力學曲線如圖 1 所示 。每個標準品的淨 AUC 通過扣除空白 對照的 AUC 獲得 。圖 2 顯示的是每個 Trolox 標準品的淨 AUC 對濃度作圖獲得的標準曲 線 。所有樣品都需要計算淨 AUC 。從 Trolox 標準曲線算出每個樣品的 ORAC 值⸺以 Trolox 濃度當量 ( TE ，單位 μM ) 表示 ，並 乘以各自的稀釋倍數算出最終 ORAC 值 ， 單位 μMTE/mL 。稀釋 100 倍的樣品的信號 值超出標準曲線範圍 ，稀釋 1000 倍的樣品 的信號值在標準曲線範圍內 ，其 ORAC 值如 表 2 所示 。待測樣品中紅酒的 ORAC 值最高 ， 而的白蔓越橘汁 ORAC 值最低 。需要注意的 是來自不同製造商生產出的產品的組分可能 不同 ，會引起樣品 ORAC 值的不同 。
總結
利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板機 Gemini™ XPS 可以方便地進行 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC 分析 ，同時儀器配套 的 SoftMax Pro 軟件可以自動計算結果並 完成標準曲線繪製 。
需要注意的是 Molecular Devices 其他多 功能微孔板讀板機如 （SpectraMax M2 、 M2e 、M3 、M4 、M5 、M5e 、Paradigm®） 以及 FilterMax™ F5 都能夠提供熒光檢測 模式 ，且都可以進行OxiSelect ORAC 分 析 。FlexStation® 3 台式多功能微孔讀板 機還能夠進行自動化加樣 。
StakMax® 微孔板堆板機可與 SpectraMax Gemini 係列以及 M 係列微孔讀板機整合使 用以提高通量。
References
1. Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.
2. Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem. 44, 701-705.
